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- PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）建立的。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
- PCR可以被認(rèn)為是與發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過程相似的技術(shù)，其結(jié)果都是以原來的DNA為模板產(chǎn)生新的互補(bǔ)DNA片段。細(xì)胞中DNA的復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對較簡單。
- PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 - 重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。
- 實(shí)驗(yàn)試劑與器材
- 模板DNA、2.5mmol/L dNTP
- Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物
- 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O
- PCR儀、移液槍、PCR板
- 配制20μL反應(yīng)體系，在PCR板中依次加入下列溶液：
- 模板DNA 2μL
- 引物1 1μL
- 引物2 1μL
- dNTP 1.5μL
- MgCl2 2μL
- 10×buffer 2μL
- ddH2O 10μL
- Taq酶 0.5 新技術(shù)推薦
使用 2D-梯度技術(shù)優(yōu)化 β-Actin 基因的擴(kuò)增。
2D-梯度技術(shù)允許在一次反應(yīng)中同時(shí)對退火溫度（從下向上）和變性溫度（從左向右）進(jìn)行優(yōu)化。較高的的變性溫度可以提高反應(yīng)特異性，而較低的變性溫度則可以減少對生物分子的壓力，從而提高產(chǎn)量。 如果使用 95 °C 變性溫度的反應(yīng)效果不理想，通過優(yōu)化變性溫度可得到明顯的改善。
設(shè)置PCR反應(yīng)程序
擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測
注意事項(xiàng)
- 1. 由于PCR反應(yīng)靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中。
- 2. 如果是公用的、沒有密碼保護(hù)的PCR儀，經(jīng)常檢查PCR儀上的程序正確與否。
- 3. 不使用過量試劑“less is usually better （more specific）”。
- 4. 試劑購回后應(yīng)分裝成小份使用，這樣一旦有污染發(fā)生，可以立即丟棄污染的試劑，不會造成大的損失；試劑分裝也有助于減少反復(fù)凍融次數(shù)（例如dNTPs對反復(fù)凍融敏感）。
- 5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。
- 6. 使用陰性對照檢查污染的發(fā)生。
- 7. 使用陽性對照（能良好擴(kuò)增的樣本）。
- 8. 電泳時(shí)使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失?。?。
- 9. 當(dāng)擴(kuò)增很長的、GC含量高的模板時(shí)或容易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)的模板時(shí)適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用；DMSO 減少二級結(jié)構(gòu)的發(fā)生，并通過減弱非特異性引物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的特異性）。
- 10. 不使用帶有自動(dòng)除霜功能的冰箱存儲酶（避免反復(fù)凍融），每次取酶時(shí)都使用新的槍頭酶，酶使用后應(yīng)立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導(dǎo)致酶變性失活。
- 11. PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間，一般為48 h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。 PCR技術(shù)應(yīng)用
- 1、生命科學(xué) a、人類基因組計(jì)劃 隨著的PCR日臻完善，科學(xué)家于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎(chǔ)上，經(jīng)過整理、分類和排列后得到的更加準(zhǔn)確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對人類基因組基本面貌的首次揭示，表明科學(xué)家們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊(yùn)涵的內(nèi)容。
b、后基因組計(jì)劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態(tài)性及其單倍型以及尋找其在生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中重要成為人們關(guān)心的熱點(diǎn)。以研究基因功能為核心的“后基因組時(shí)代”已經(jīng)來臨，大規(guī)模的結(jié)構(gòu)基因組、蛋白質(zhì)組以及藥物基因組的研究計(jì)劃已經(jīng)成為新的熱點(diǎn)。
c、物種的分類、進(jìn)化及親緣關(guān)系 可以進(jìn)行物種進(jìn)化的保守性分析及物種多態(tài)性分析、物種鑒定。
2、醫(yī)藥
- a、疾病的診斷和治療 遺傳性疾病 。
- b、致病病原體的檢測 包括細(xì)菌、病毒
- c、DNA指紋、個(gè)體識別
- d、生物工程制藥
- e、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥及疾病模型 3、農(nóng)業(yè)科學(xué)
- a、轉(zhuǎn)基因植物 按其功能主要分提高產(chǎn)量、抗病力、抗除草劑、改良品質(zhì)和發(fā)育調(diào)節(jié)。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。
- b、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 在農(nóng)業(yè)方面，主要在改良畜禽生產(chǎn)性狀,提高畜禽抗病力及利用轉(zhuǎn)基因畜禽生產(chǎn)非常規(guī)畜產(chǎn)品。4、考古學(xué)及歷史事件解讀
- 利用人類短串聯(lián)重復(fù)STR-PCR技術(shù)，研究人類種族的遺傳多態(tài)性，效果非常穩(wěn)定。目前此技術(shù)已廣泛用于生物考古、種系發(fā)育、民族學(xué)、人類學(xué)和考古學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域中。
a、食品微生物的檢測 傳統(tǒng)的致病菌檢測首先經(jīng)過長時(shí)間的培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，應(yīng)用PCR技術(shù)則非常迅速、準(zhǔn)確。主要用于：食品致病菌的檢測，如肉毒唆菌等；乳酸菌的檢測；水中細(xì)菌指標(biāo)測定。
b、轉(zhuǎn)基因食品的檢測 目前世界轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)有100多物種，大多數(shù)已經(jīng)用于食品。轉(zhuǎn)基因食品對人體健康的危害及對生態(tài)的影響也日受世界廣泛的重視，因此對轉(zhuǎn)基因食品的檢測成為控制其泛濫的一種手段。
c、動(dòng)、植物檢疫 靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進(jìn)出口口岸的門衛(wèi)，檢查出入國門的人員、動(dòng)、植物（種畜、種籽）等是否攜帶烈性傳染?。ò獭?dòng)物病毒、植物病毒等）病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國門之外，是提高我國綜合國力的必要保證。
